Съвременни проблеми на науката и образованието. Напредък в съвременната естествена наука Как да преброим анализа на перитонеалната течност

1

Протеомният профил на перитонеалната течност при външна генитална ендометриоза беше изследван с помощта на двумерна електрофореза и масова спектрометрия по време на полет. Разкрити са протеини на различия, които се появяват при външна генитална ендометриоза: аполипопротеин A-IV, глобулин, който свързва половите хормони, компоненти на комплементната система C3 и C4b. Протеините, които липсват при външната генитална ендометриоза, включват диференциращ фактор на пигментния епител, транстиретин, хаптоглобин, α-1-антитрипсин и инхибитор на апоптозата 6. Възможната роля на идентифицираните протеини в развитието на основни нарушения при ендометриозата е обсъдени. Откритите различителни протеини могат да се използват като маркери на това заболяване.

външна генитална ендометриоза

перитонеална течност

протеомичен анализ

протеинови разлики

1. Адамян, Л.В. Ендометриоза: ръководство за лекари / L.V. Адамян, В.И. Кулаков, Е.Н. Андреева // М.: Медицина, 2006. - 416 с.

2. Говорун, В.М. Протеомични технологии в съвременната биомедицинска наука / В.М. Говорун, А.И. Арчаков // Биохимия. - 2002.– No 10.– С.1341–1359.

3. Дедул, М.И. Система за протеолиза в кръвен серум и перитонеална течност по време на хирургично лечение на пациенти с ендометриоза / М.И. Дедул, Л.Е. Радецкая, Л.Н. Тухла // Новини от хирургията. - 2006. - No 3. - С.74-80.

4. Ищенко, А.И. Ендометриоза: диагностика и лечение / A.I. Ishchenko, E.A. Кудрина // М.: ГЕОТАР-МЕД, 2002. - 104 с.

5. Линде, В.А. Протеомни технологии при изследване на ендометриоза / V.A. Линде, Л.Р. Томай, В.О. Gun'ko et al. // Med. вестн. Южна Русия. - 2013. - No 4. - С.12-16.

6. Минкевич, Н.И. PEDF-неинхибиторен серпин с невропротективни и антиангиогенни действия / N.I. Минкевич, В.М. Липкин, И. А. Костанян // ActaNaturae. - 2010. - No 3. - С.74-84.

7. Bedaiwy, M.A. Перитонеална течна среда при ендометриоза. Клиникопатологични последици / М.А. Bedaiwy, T. Falcone // Minerva Ginecol. –2003. - V.55, N 4. - P.333-345.

8. Бернард, К.Р. Методи във функционалната протеомика: двумерна електрофореза в полиакриламиден гел с имобилизирани градиенти на рН, разграждане в гела и идентификация на протеини чрез мас спектрометрия / K.R. Бернард, К.Р. Джоншер, К.А. Resing, N. G. Ahn, Methods Mol. Biol. - 2004. –V. 250. - С. 263-282.

9. Хамънд, Г.Л. Разнообразни роли на глобулина, свързващ половите хормони в репродукцията / G.L. Хамонд // Biol. Reprod. - 2011. - V. 85, N 3. - P.431-441.

10. Kabut, J. Нива на компонентите на комплемента iC3b, C3c, C4 и SC5b-9 в перитонеална течност и серум на безплодни жени с ендометриоза / J. Kabut, Z. Kondera-Anasz, J. Sikora et al. // Фертил. Стерил. –2007. - V.88, N 5. - P.1298-1303.

11. Ричардсън С. Дж. Клетъчна и молекулярна биология на транстиретин и тиреоидни хормони / S.J. Ричардсън // Int. Преп. Цитол. - 2007. - V. 258. - С.137-193.

12. Сариас М.Р. Роля за човешкия Sp alpha като рецептор за разпознаване на образци / M.R. Sarrias, S. Roselló, F. Sánchez-Barbero et al. // J. Biol. Chem. - 2005. - V. 280, N 42. - С. 35391-35398.

13. Сполдинг H.L. Apo A-IV: актуализация на регулацията и физиологичните функции / H.L. Сполдинг, Е. Делвин, М. Ламбърт и сътр. // Biochim. Biophys. Acta. - 2003. - V. 1631, No 2. - С. 177-187.

14. Wassell J. Хаптоглобин: функция и полиморфизъм / J. Wassell // Clin. Лаборатория. –2000. - V. 46, N 11-12. - С.547-552.

Актуалността на изследването на външната генитална ендометриоза (EGE) е свързана с високата честота на разпространение на тази патология сред жените в детеродна възраст и нейното значително въздействие върху тяхното репродуктивно здраве и стандарт на живот. В момента е показана важната роля на перитонеалната течност (RV) в патогенезата на ендометриозата, тъй като именно в него се случва развитието и растежа на ендометриоидните огнища. Изследването на протеиновия състав на панкреаса с помощта на протеомни технологии, насочени към изучаване на набора от протеини, експресирани от генома, създава качествено нови възможности за задълбочаване на разбирането на молекулярните механизми на развитието на ендометриозата, нейното прогнозиране и ранна диагностика.

Обективен... Да се \u200b\u200bизследва протеомният спектър на панкреаса на жени със и без IGE.

Материали и методи за изследване

Проучването включва 20 пациенти в репродуктивна възраст (средна възраст 29,3 ± 0,3 години), от които 10 пациенти с EGE с III-IV стадии на заболяването според класификацията r-AFS (основна група) и 10 без ендометриоза (контролна група) . Материалът за изследване е панкреасът, получен от задното маточно пространство по време на лапароскопия. Протеомният анализ на панкреаса се извършва с помощта на двуизмерна електрофореза в полиакриламиден гел (Protein IEFCell и ProteanIIxiMulti-Cell устройства, Bio-Rad, САЩ), последвано от оцветяване на протеини със сребърни йони. Идентифицирането на протеини след тяхната трипсинолиза се извършва чрез масова спектрометрия MALDI по време на полет на масспектрометър Autoflex II (Bruker, Германия) с помощта на програмата MascotMSSearch (MatrixScience, САЩ) и базите данни NCBI и Swiss-Prot. за идентифициране на протеини са взети за надеждни при ниво на значимост не по-малко от 95% и степен на покритие на последователността не по-малко от 60%.

Значимостта на разликите в протеомния спектър на панкреаса на жените в контролната и основните групи беше определена с помощта на c2-тест (Statistica версия 6.0. От StatSoft. Jnc.). Резултатите бяха оценени като статистически значими при p<0,05.

Резултати от изследването и дискусия

В резултат на извършения протеомен анализ на панкреаса бяха разкрити редица различни протеини, чието наличие или отсъствие се проявява само по време на IGE (виж таблицата, фиг.). По този начин в панкреаса на жените в основната група е установена появата на следните протеини: аполипопротеин A-IV, глобулин, свързващ половите хормони (SHBG), компоненти на комплементната система C3 и C4b, които не са открити при пациенти от контролата група.

маса 1

Идентифицирани панкреатични протеини на жени в контролната и проучваната група

	Име на протеин
	α-1-антитрипсин
	Фактор на диференциация на пигментния епител
	Компонент на комплементната система C3
	Аполипопротеин A-IV
	Хаптоглобин
	Глобулин, който свързва половите хормони
	Инхибитор на апоптозата 6
	Компонент на комплементната система C4-b
	Транстиретин

Забележка: pI - изоелектрична точка, Mm - молекулно тегло, "+" - наличие на протеин, "-" - липса на протеин, p - значимост на разликите между групите.

И Б.

Фигура: 1. Протеомни карти на перитонеалната течност на жените от контролната (А) и основната (В) групи

Забележка. Номерирането на протеини съответства на това в таблицата

Увеличаването на производството (и като следствие появата в панкреаса) на аполипопротеин A-IV, който има антиоксидантни и противовъзпалителни свойства, очевидно има компенсаторна стойност при условия на оксидативен стрес и възпаление, съпътстващи развитието на този патология.

Повишеното съдържание на SHBG в ендометриозата, което регулира бионаличността на стероидни хормони за ендометриални клетки, създава условия за локален хиперестрогенизъм. При тези условия става възможно да се засили пролиферативният потенциал на ендометриоидните хетеротопични клетки.

Повишената секреция от перитонеалните макрофаги на компонентите на комплементната система C3 и C4b, които участват във възпалителната реакция, неутрализирането на апоптотичните клетки и имунните комплекси, има определен принос за механизмите на развитие на ендометриоза и свързано с ендометриоза безплодие.

Заедно с тези отклонения в IGE, 5 протеини отсъстват в протеомния спектър на панкреаса: фактор на диференциация на пигментния епител, транстиретин, инхибитор на апоптозата 6, хаптоглобин и α-1-антитрипсин.

Факторът на диференциация на пигментния епител е един от най-мощните антиангиогенни и антипролиферативни фактори; поради това инхибирането на неговата експресия може да бъде една от причините, водещи до намаляване на апоптозата на ендометриума и увеличаване на ангиогенезата, насърчаване на имплантирането и растежа на хетеротопии.

Липсата в панкреаса на жените на основната група транстиретин, която транспортира Т3 и Т4, очевидно създава локален излишък на хормони на щитовидната жлеза, чийто токсичен ефект води до увреждане на репродуктивните органи. Тиреоидните хормони, модулиращи ефектите на естрогените на клетъчно ниво, могат да допринесат за развитието на нарушения в хисто- и органогенезата на хормон-чувствителните структури и влошаване на хода на ендометриозата.

Сред белтъците, които не са идентифицирани в IGE, важна роля в регулирането на имунния отговор играе инхибиторът на апоптозата 6, секретиран от макрофагите. Възможно е нарушението на експресията на този протеин да доведе до образуване на дисбаланс на имунокомпетентни клетки в панкреаса (поради потискане на апоптозата на Т лимфоцитите и NK клетките).

Липсата на неензимен антиоксидант хаптоглобин в панкреаса, може да се предположи, допринася за засилване на оксидативния стрес, който се развива при ендометриоза.

С тази патология, а-1-антитрипсин, инхибитор на серинови протеази, които участват пряко в инвазията на ендометриални клетки, също не е открит в панкреаса, което очевидно причинява дисбаланс в системата протеаза-инхибитор, улеснява имплантирането на ендометриални клетки.

Извършените проучвания показват, че развитието на ендометриоза възниква на фона на промени в производството на редица важни протеини, участващи в регулирането на хормоналното действие, ангиогенезата, апоптозата, редокс процесите, възпалението и имунния отговор.

констатации

1. Модифицирането на протеомния спектър на панкреаса е важен патогенетичен фактор за развитието на IGE.

2. Протеини, които липсват или се появяват в панкреаса при ендометриоза, могат да служат като информативни маркери за това заболяване.

Рецензенти:

Avrutskaya VV, доктор по медицина, водещ изследовател на Акушерско-гинекологичния отдел, ръководител на амбулаторния отдел на Федералната държавна бюджетна институция "RNIIAP" на Министерството на здравеопазването на Русия. Федерална държавна бюджетна институция "Ростовски изследователски институт по акушерство и педиатрия" към Министерството на здравеопазването на Русия, Ростов на Дон;

Kaushanskaya LV, д.м.н., главен изследовател на Акушерско-гинекологичния отдел на Федералната държавна бюджетна институция "RNIIAP" на Министерството на здравеопазването на Русия. Федерална държавна бюджетна институция "Ростовски изследователски институт по акушерство и педиатрия" към Министерството на здравеопазването на Русия, Ростов на Дон.

Библиографска справка

Томай Л.Р., Линде В.А., Ермолова Н.В., Гунко В.О., Погорелова Т.Н. РОЛЯ НА ПРОТЕМИЧЕСКИЯ ДИБАЛАНС НА ПЕРИТОНАЛНАТА ТЕЧНОСТ В ПАТОГЕНЕЗАТА НА ВЪНШНАТА ГЕНИТАЛНА ЕНДОМЕТРИОЗА // Съвременни проблеми на науката и образованието. - 2014. - No6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id\u003d17171 (дата на достъп: 01.02.2020 г.). Предлагаме на вашето внимание списанията, публикувани от "Академия по естествени науки"

Натрупването на свободна течност в коремната кухина възниква в резултат на възпалителна реакция, нарушен лимфен поток и кръвообращение поради различни причини. Това състояние се нарича асцит (воднянка) и появата му може да доведе до развитие на сериозни последици за човешкото здраве.

Течността, натрупана в перитонеума, е идеално местообитание за патогенна микрофлора, която е причинител на перитонит, хепаторенален синдром, пъпна херния, чернодробна енцефалопатия и други също толкова опасни патологии.

За диагностициране на асцит се използва един от най-безопасните и неинвазивни, но много точни методи - изследване, използващо ултразвукови вълни. Откриването на наличие на течност в коремната кухина чрез ултразвук се извършва според указанията на лекуващия лекар въз основа на съществуващите клинични признаци на патологичния процес.

Коремната кухина е анатомично обособена зона, която постоянно отделя влага, за да подобри плъзгането на висцералните листове на перитонеума. Обикновено този излив може да се абсорбира динамично и да не се натрупва в удобни за него зони. В нашата статия искаме да предоставим информация за причините за необичайно запазване на течности, диагностициране на патологично състояние чрез ултразвук и ефективни методи за неговото лечение.

Защо свободната течност се натрупва в коремната кухина?

Асцитът се развива поради различни видове патологични процеси в тазовите органи. Първоначално натрупаният транссудат няма възпалителен характер, количеството му може да варира от 30 ml до 10-12 литра. Най-честите причини за неговото развитие са нарушената секреция на протеини, които осигуряват непропускливостта на тъканите и пътищата, които провеждат лимфата и циркулиращата кръв.

Това състояние може да провокира вродени аномалии или развитие в организма:

• цироза на черния дроб;
• хронична сърдечна или бъбречна недостатъчност;
• портална хипертония;
• протеиново гладуване;
• лимфостаза;
• туберкулозни или злокачествени лезии на перитонеума;
• захарен диабет;
• системен лупус еритематозус.

Често воднянка се развива по време на образуването на тумороподобни образувания в млечните жлези, яйчниците, храносмилателните органи, серозните мембрани на плеврата и перитонеума. В допълнение, свободната течност може да се натрупва на фона на усложнения от следоперативния период, псевдомиксома на перитонеума (натрупване на слуз, която претърпява реорганизация с течение на времето), амилоидна дистрофия (нарушение на протеиновия метаболизъм), хипотиреоидна кома (микседем).

Механизмът за образуване на воднянка е проникването в коремната кухина на течност от основните лимфни канали, кръвоносните съдове и тъканите на органите

Признаци на асцит

В ранните етапи от развитието на това състояние пациентите нямат оплаквания; натрупването на свободна течност може да бъде открито само с помощта на ултразвук. Видимите симптоми се появяват, когато количеството транссудат надвишава един и половина литра, човек чувства:

• увеличаване на коремната корема и телесното тегло;
• влошаване на общото благосъстояние;
• усещане за пълнота в коремната кухина;
• подуване на долните крайници и тъканите на скротума (при мъжете);
• оригване;
• киселини в стомаха;
• гадене;
• затруднено дишане;
• метеоризъм;
• тахикардия;
• изпъкналост на пъпния възел;
• дискомфорт и болка в корема;
• нарушения на изпражненията и пикочните пътища.

Когато в перитонеума се натрупа голямо количество излив, човек може да чуе характерно изпръскване на течност и да усети вълна.

Ако ултразвуковото изследване на коремната кухина покаже, че има излишна влага, лекуващият лекар трябва точно да установи първопричината за патологичното състояние. Изпомпването на натрупания транссудат не е ефективен метод за лечение на асцит.

Подготовка за ултразвуково сканиране и хода на провеждането му

Това проучване няма никакви противопоказания или ограничения, в спешни случаи се извършва без предварителна подготовка на пациента. Планираната процедура изисква подобрена визуализация на патологичните промени в органите. Препоръчва се на пациента да изключи от диетата храни, съдържащи голямо количество фибри и увеличаване на образуването на газове 3 дни преди изследването.

В навечерието на изследването изпийте слабително или направете прочистваща клизма. За да намалите натрупването на газове в червата в деня на ултразвуковото сканиране, трябва да вземете Mezim или активен въглен. Съвременните методи на ултразвукова диагностика позволяват да се определят най-вероятните области на натрупване на свободна течност в коремната кухина.

Ето защо квалифицирани специалисти изследват следните анатомични области:

• Горният "етаж" на перитонеума, който се намира под диафрагмата. От особена диагностична стойност са пространствата, разположени под черния дроб и образувани от основния участък на тънките черва - възходящата и низходящата част на дебелото черво. Обикновено така наречените странични канали не съществуват - обвивката на перитонеума е плътно прикрепена към червата.
• Малкият таз, в който с развитието на патологични процеси може да се натрупва излив, изтичащ от страничните канали.

Физическите характеристики на натрупаната в перитонеума влага по някаква причина не позволяват ултразвуковата вълна да бъде отразена, това явление прави диагностичната процедура възможно най-информативна. Наличието на излив в изследваните анатомични пространства създава тъмен движещ се фокус върху монитора на апарата. При липса на свободна течност диагнозата отнема не повече от 5 минути.

За да се открие излишната влага, ултразвуковата сонда се премества по предната и средната аксиларна линия от двете страни на тялото на пациента надолу по корема

Ако не е възможно да се открие транссудат, косвените признаци могат да показват неговото присъствие:

• изместване на бримките на дебелото черво;
• промяна в звука по време на перкусия (потупване) - тимпанична в горните части на перитонеума, тъпа в долната.

Видове коремна воднянка чрез ултразвук

Международната класификация на болестите не разграничава асцита като отделно заболяване - това състояние е усложнение на последните етапи на други патологични процеси. Според яркостта на клиничните симптоми се различават следните форми на асцит:

• първоначално - количеството натрупана вода вътре в корема достига 1,5 литра;
• с умерено количество течност - проявява се с подуване на краката, забележимо увеличаване на размера на гръдния кош, задух, киселини, запек, усещане за тежест в корема;
• масивна (обемът на излива е повече от пет литра) е опасно състояние, характеризиращо се с напрежение в стените на коремната кухина, развитие на недостатъчност на функцията на сърдечната и дихателната системи и инфекция на транссудата.

При бактериологичната оценка на качеството на свободната течност, която се получава при специални лабораторни условия, се прави разлика между стерилна (липса на патогенни микроорганизми) и заразена (наличие на патогенни микроби) воднянка.

Според диагностичните прогнози има асцит, който се поддава на медикаментозна терапия, и стабилно патологично състояние (повторното му възникване или не се поддава на лечение).

Какво се прави след потвърждаване на патологията с ултразвук?

Курсът на лечение зависи от това какво заболяване е причинило натрупването на излишна влага в перитонеума. За точно диагностициране на патологичния процес практикуващите специалисти провеждат цялостен преглед на пациента, включително:

• биохимични и общоклинични анализи на кръв и урина;
• изследвания на онкологични маркери и показатели на електролитния метаболизъм;
• анкетна рентгенография на гръдния кош и коремните кухини;
• коагулограма - оценка на параметрите на коагулационната система;
• ангиография на кръвоносни съдове, позволяваща да се оцени тяхното състояние;
• ЯМР или КТ на корема;
• хепатосцинтиграфия - съвременна техника за изследване на черния дроб с помощта на гама камера, която позволява визуализиране на орган;
• диагностична лапароскопия с медицинска пункция на асцитна течност.

За изпомпване на транссудата от коремната кухина се използва методът на терапевтична лапароцентеза - прави се пункция в предната стена на корема, чрез която се отстранява излишната течност

На пациентите с цироза на черния дроб се препоръчва да се подложат на вътрехепатално портосистемно шунтиране, чиято техника се състои в поставяне на метален мрежест стент, за да се създаде изкуствена връзка между яката и чернодробните вени. Ако заболяването е тежко, е необходима трансплантация на органи.

В заключение на горната информация бих искал да подчертая още веднъж, че натрупването на свободна течност в коремната кухина се счита за неблагоприятна проява на сложния ход на основното заболяване. Развитието на асцит може да провокира нарушение на функционалната активност на сърцето и далака, вътрешно кървене, перитонит, мозъчен оток.

Смъртността на пациенти с масивна коремна воднянка достига 50%. Мерките, които предотвратяват появата на това патологично състояние, се състоят в навременно лечение на инфекциозни и възпалителни процеси, правилно хранене, отказ от консумация на алкохол, умерен спорт, превантивни прегледи от медицински специалисти и точно изпълнение на техните препоръки.

1

Уместност. Всяка хирургична травма на перитонеума е стрес фактор, а адхезията е едно от най-честите усложнения. Цитологичните промени в перитонеалната течност оказват определено влияние върху този процес, чието проучване ще даде възможност да се предложат нови подходи за нейната контролируемост не само по време на планирани операции, но и при екстремни условия.

Цел на изследването. Да се \u200b\u200bизследват цитологичните промени в перитонеалната течност в динамиката на оперативния стрес.

Материали и методи. В проучването са участвали 60 плъха на възраст от 3 месеца, достигащи маса от 250-300 g, които са били нанесени със стандартна хирургична травма. Изследването на клетъчния състав на перитонеалната течност в процеса на адхезиогенеза беше проведено върху експериментални животни. За да се направи това, в рамките на 5 дни преди прилагането на операционната травма и през ден в продължение на 30 дни в следоперативния период, перитонеалната течност е взета с последващото цитологично изследване. При приемане на перитонеална течност животното предварително е фиксирано в разработено и патентовано устройство (RF патент № 72405, регистриран на 20.04.2008 г.). Приемът на перитонеална течност включва следните етапи: лапаролифтинг на предната коремна стена с помощта на елементите на предложеното устройство, прием на перитонеална течност с помощта на разработеното устройство за пункция на коремната кухина (RF патент № 89954, регистриран на 02.12.09 г.) ). Материалът за цитологично изследване се центрофугира, супернатантата се отстранява и от получената суспензия се правят цитонамазки. Мазките се оцветяват по метода на Романовски-Гиемза и се подлагат на цитологичен анализ с помощта на светлинна микроскопия.

Нивото на адхезия е изследвано на 90 плъхове. При три (по 30 животни) от предварително описаните групи се изчислява нивото на адхезивния процес в динамиката на хирургичната травма на 10-ия, 20-ия и 30-ия ден (последният период характеризира времето на окончателното образуване на перитонеални сраствания ). За тази цел след релапаротомия коремната кухина беше ревизирана и беше определен морфологичният тип на всяка открита адхезия.

Изчисляването на нивото на адхезивния процес се извършва в абсолютни числа, като се използва предварително разработена и патентована математическа формула. Резултатите бяха обработени с помощта на стандартни статистически методи.

Резултати. Цитологичното изследване на перитонеалната течност в подготвените цитонамазки на всички експериментални групи разкрива следните клетъчни елементи: еритроцити, лимфоцити, левкоцити, еозинофили, сегментирани левкоцити, моноцити, мезотел; макрофагите и фибробластоподобните клетки са по-рядко срещани. Цитологичната картина на перитонеалната течност има ясна връзка с обема на хирургичната травма и функционалните нарушения на перитонеума.

Клетъчният състав на перитонеалната течност в групата със стандартна хирургична травма се характеризира със следните промени: броят на еритроцитите се възстановява до 10-ия ден след хирургичната травма. Левкоцитите намаляват в рамките на 3-5 дни след операцията с установяване на средно нормално ниво на левкоцитите с 9 дни; клетките от моноцитно-макрофагичната серия се увеличиха само на 8-10-ия ден; сравнително малко увеличение на броя на лимфоцитите е отбелязано през първите 5-7 дни след операцията.

На 10-ия ден след прилагането на стандартно хирургично увреждане, изчисленото USP е 0,31 ± 0,01 cm3, с увеличаване на периода USP има тенденция да се увеличава, достигайки 0,34 ± 0,02 cm3 до 20-ия ден и от 30 дни. - 0,36 ± 0,01 cm3.

Констатации. Клетъчният състав на перитонеалната течност е в пряка зависимост от обема на хирургичната травма, докато стабилността на качеството на клетъчния състав на перитонеалната течност е придружена от промяна в нейното количество в динамиката на регенеративния отговор на перитонеума . Възстановяването на първоначалния характер на цитологичния компонент на перитонеалната течност с 15-23 дни не осигурява стабилизиране на адхезиогенезата, която продължава до 30 дни.

Библиографска справка

Мендалиева А.С. ЦИТОЛОГИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПЕРИТОНАЛНАТА ТЕЧНОСТ В ДИНАМИКАТА НА ОПЕРАЦИОННИЯ СТРЕС // Напредък в съвременната природознание. - 2011. - No 8. - С. 121-122;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id\u003d27712 (дата на достъп: 01.02.2020). Предлагаме на вашето внимание списанията, публикувани от "Академия по естествени науки"

УДК 579.842.23+ 616-092.19

Т.П. Старовойтова, Т.А. Иванова, Г.Б. Мухтургин, С.А. Витязева, В.И. Дубровин,

К.М. Коритов, С.В. Балахонов

ПРОМЕНИ В КЛЕТОВИЯ СЪСТАВ НА ПЕРИТОНЕАЛНАТА ТЕЧНОСТ В БЕЛИ МИШИ ПО ВРЕМЕ НА ИНФЕКТИВЕН ПРОЦЕС, ПРИЧИНЕН ОТ ЙЕРСИНИЯ ПЕСТИС С РАЗЛИЧЕН ПЛАЗМИДЕН СЪСТАВ

Иркутски научноизследователски институт за борба с чумата в Сибир и Далечния изток (Иркутск)

Статията представя данни за ефекта на плазмидния състав на чумния микроб върху субпопулационния състав на мононуклеарните клетки на перитонеалната течност на бели мишки в ранните стадии на инфекциозния процес. Доказано е, че промените в клетъчния състав на перитонеалната течност при опитни животни зависят от плазмидния профил на щамовете на чумните микроби. В хода на експеримента беше разкрито и постепенно изменение на количествения състав на мастоцитите на перитонеалната течност на бели мишки, заразени с щамове Yersinia pestis с различен плазмиден спектър. Ключови думи: Yersinia pestis, перитонеална течност, вирулентност

ПРОМЕНИ В КЛЕТНИТЕ КОМПОНЕНТИ НА ПЕРИТОНЕАЛНАТА ТЕЧНОСТ НА БЕЛИ МИШИ С ИНФЕКЦИЯ, ПРИЧИНЕНА ОТ ЙЕРСИНИЯ ПЕСТИС С РАЗЛИЧЕН ПЛАЗМИДЕН ПРОФИЛ

Т.П. Старовойтова, Т.А. Иванова, Г.Б. Mukhturgin, S.A. Витязева, В.И. Дубровина,

К.М. Коритов, С.В. Балахонов

Иркутски изследователски институт за борба с чумата в Сибир и Далечния изток, Иркутск

Статията представя данните за влиянието на плазмения профил на Yersinia pestis върху структурата на субпопулацията на мононуклеарни клетки от перитонеална течност на мишки в ранните стадии на инфекциозния процес. Показано е, че промяната на клетъчния състав на перитонеалната течност на експерименталните животни зависи от плазмидния профил на щамовете Yersinia pestis. Определен е фазовият характер в промените на количествения състав на мастоцитите на перитонеалната течност на бели мишки, заразени с щамове Y. pestis с различен плазмиден спектър. Ключови думи: Yersinia pestis, перитонеална течност, вирулентност

По-голямата част от факторите на вирулентност на Yersinia pestis са свързани с плазмидния състав. Геномът на причинителя на чумата на основния подвид - Yersinia pestis subspecies pestis - има три плазмида - pYU (45MDa), pYP (6MN) и pYT (61MDa), тяхната роля е добре проучена при прилагането на патогенните свойства на Yersinia . С присъствието на pYV плазмида, щамовете Yersinia проявяват много фенотипни характеристики: клетъчна адхезия, автоаглутинация, повърхностна аглутинация, както и синтез на протеини на външната мембрана, включително V- и W-антигени и други протеини, чието действие е насочено към потискане фагоцитната активност на имунните клетки.системи. Плазмидите pYP и pYT са специфични за видовете. Плазмид рYP определя синтеза на бактериоцин пестицин 1 и плазминогенен активатор, докато плазмид рYТ кодира двата най-добре проучени фактора на вирулентност - миши токсин и капсули F1. Отличителна черта на патогена, циркулиращ в тувинския фокус, е наличието в неговия геном на допълнителен четвърти плазмид pTRZZ с все още неясни функции. Смята се, че този плазмид е генетично модифицирана версия на 9,5 kD резидентен плазмид, носещ гените pla (плазминогенен активатор) и pstl (пестицин 1). Загубата на плазмид води до промяна в биохимичните и културните свойства, както и до намаляване или пълна загуба на вирулентността на патогена.

Водещият клиничен признак на чумна инфекция и интоксикация, който определя тежестта на хода

а резултатът от заболяването е нарушение на хомеостазата на макроорганизма. Основните цели за ендотоксин са полиморфонуклеарни левкоцити, макрофаги, моноцити, ендотелни клетки и други клетъчни елементи. Промените в клетъчния състав на перитонеалната течност могат да се разглеждат като диагностичен критерий за тежестта на заболяването при много заболявания, включително чума. В това отношение оценката на количествения и качествения клетъчен състав на перитонеалната течност при бели мишки по време на инфекциозния процес, причинен от Y. pestis с различен плазмиден състав, представлява голям интерес.

Цел на работата: изследване на динамиката на промените в субпопулационния състав на мононуклеарни клетки на перитонеалната течност на бели мишки в ранните етапи на експериментална чумна инфекция.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Експерименталният модел в експериментите е 175 безпородни, но стандартни по отношение на условията и теглото (18-20 g) бели мишки от двата пола. Животните бяха извадени от експеримента в съответствие с "Правилата за лабораторна практика в Руската федерация", одобрени със заповед на Министерството на здравеопазването на Руската федерация № 267 от 19 юни 2003 г. и Националния стандарт на Руска федерация GOST R 53434-2009 "Принципи на добрата лабораторна практика".

Шест щама на Y. pestis subsp. pestis и Y. pestis subsp. altaica от колекцията на Ir-

маса 1

Характеристики на тестваните щамове на чумния микроб

Щам Място на изолация Плазмиден състав Вирулентност за бели мишки (Обо), м. До.

Y. pestis subsp. pestis I-2638 Тувански природен фокус на чума pYP + pYV + pTP33 + pYT + 10 / силно вирулентен

Y. pestis subsp. pestis I-3479 Иркутски противочумнен институт pYP + pYV-pTP33 + pYT + авирулентен

Y. pestis subsp. pestis I-3480 Иркутски институт против чума pYP-pYV-pTP33 + pYT + авирулентен

Y. pestis subsp. altaica I-2359 Горно-Алтайски природен чумен фокус pYP + pYV + pYT + 4 x 104 / леко вирулентен

Y. pestis subsp. altaica I-2948 Горно-Алтайски природен чумен фокус pYP-pYV + pYT + 3 x 108 / остатъчна вирулентност

Y. pestis subsp. altaica I-2948/3 Иркутски институт против чума pYP-pYV-pYT + авирулентен

куцк изследователски институт против чума на Rospotrebnadzor (Таблица 1).

Интактните бели мишки бяха разделени на 6 експериментални и 1 контролна група от по 25 животни. Животните от експерименталните групи бяха заразени с Y. pestis в концентрация 1 х 106 mc в обем от 0,5 ml чрез интраперитонеален метод. На експериментални животни от група I се инжектира двудневна култура от Y. pestis subsp. pestis I-2638, група II - Y. pestis subsp. pestis I-3479, група III - Y. pestis subsp. pestis I-3480, експериментална група IV от животни са заразени с референтния горно-алтайски щам Y pestis subsp. altaica I-2359, група V - Y. pestis subsp. altaica I-2948, група VI - от селекционния щам Y. pestis subsp. altaica I-2948/3.

Вземането на проби от материал от експериментални животни (перитонеална течност) се извършва след 30, 60, 90, 120 и 180 минути. Общият брой на ядрените клетки в 1 ml перитонеална течност се отчита във фиксирани препарати, оцветени по стандартни методи. За бактериологичен анализ кръв от сърцето и перитонеалната течност (по 0,1 ml) се инокулира върху твърда хранителна среда (агар на Hottinger, рН 7,2).

Използвахме методите на анкетната микроскопия. Количествената оценка на общия брой левкоцити се извършва с помощта на унифициран метод за броене на клетки в камера на Горяев. Процентът на различните видове левкоцити се извършва по метода на морфологично изследване на перитонеална течност в цитонамазки. При изследването на препарати с помощта на компютърната програма "MoticImagesPlus" (версия 2) се извършва диференцирано броене на базофили на тъканите (TC), измерват се техният диаметър и площ. Степента на MC активиране се оценява чрез индекса на клетъчна дегранулация (IDTC) - процентното съотношение на дегранулираните затлъстели базофили към общия им брой.

Автоматичният анализ на изображението беше извършен с помощта на светлинен микроскоп Zeiss (Германия) с видеокамера Moticam 2000, разделителна способност 1392 x 1040 пиксела, прибл. 10, кн. 100.

Значимостта на резултатите от изследванията е получена чрез математически методи за статистическа обработка, използвайки сравнителен анализ чрез t-тест на Student и с помощта на компютърната програма Statistica, версия 6.0 (StatSoft Inc. 19842001, IPCHI 31415926535897) и софтуерен пакет

Microsoft Office Excel (2003). Резултатите се считат за значими по отношение на контрола при p< 0,05.

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Общият брой на клетките в перитонеалната течност при непокътнати животни е 4,3 ± 0,9 x 103 на 1 cm3, докато макрофагите са преобладаващият клетъчен тип и представляват 60,5 ± 5,6% от общия брой клетки, а лимфоцитите представляват 17,0 ± 2,8 %; 5,5 ± 0,8% са мезотелиални клетки и други клетъчни елементи.

При заразените бели мишки се наблюдава фазичност при промяната в общия брой ядрени клетки. При животни, заразени с вирулентния Y. pestis subsp. pestis I-2638, след 30 минути общият брой на ядрените клетки се увеличава рязко до 1,5 ± 0,4 х 104 на 1 см3, което е 3,4 пъти по-високо, отколкото при непокътнатите животни. До 60 минути от проучването показателите намаляват до непокътнати стойности, като продължават да намаляват през следващите периоди. Цитологичната картина на перитонеалната течност има ясна връзка с заразяващата култура. При животни от група I, 30 минути след инфекцията, е отбелязано увеличение на броя на лимфоцитите, надвишаващо стойността при непокътнати животни с 4 пъти поради рязкото намаляване на броя на моноцитите. Тези промени бяха разкрити през всички периоди на наблюдение. В перитонеалната течност на бели мишки, заразени с Y. pestis subsp. pestis I-2638, след 120 минути от началото на експеримента е регистрирано увеличение на броя на сегментираните неутрофили с 2,5 пъти в сравнение с контролата (р< 0,05), и незначительное увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов. На последнем сроке исследования в мазках перитонеальной жидкости выявляется большое количество фибробластов, агрегация лимфоцитов и большое количество делящихся клеток.

При бели мишки, заразени с Y. pestis subsp. altaica I-2359, Y. pestis subsp. pestis I-3479 и Y. pestis subsp. altaica I-2948/3, няма статистически значими промени 30 минути след началото на експеримента. До 180 минути броят на ядрените клетки в перитонеалния ексудат надвишава контролните стойности с 2,8 (p< 0,01), 1,9 (р < 0,05) и 1,5 раза соответственно. При введении животным Y. pestis subsp. pestis И-3480 и Y. pestis subsp. altaica И-2948 через 30 мин отмечается повышение общего числа ядерных клеток с последующим снижением (120 мин) до уровня контроля, и к 180 мин показатель вновь увеличивается.

При изследване на намазки от перитонеална течност при животни от всички експериментални групи се регистрира клетъчна пролиферация на лимфоцити, хистиоцити, увеличаване на еозинофилите, тъканните базофили, плазмоцитите, мезотелиевите клетки и фибробластите.

Оценката на морфологичните свойства на базофилите, техния брой и функционална активност представляват интерес при изследването на клетъчния състав на перитонеалната течност на заразените животни.

Установено е, че при експериментални бели мишки има фазичен характер в промяната в количествения състав на тъканните базофили на перитонеалната течност. Увеличение на техния брой при животни, заразени с Y. pestis subsp. pestis I-2638, се записва 60 минути след въвеждането на културата, надвишавайки стойностите при непокътнати животни с 2,6 пъти (р< 0,05). Затем данные показатели снижаются (90-120 мин) до значений ин-тактных животных, к 180 мин вновь возрастают, достигая значений 8,5 против 2,5 в контроле (р < 0,05). Часть ТК представлены интестинальными - незрелыми формами (рис. 1), появление которых можно расценивать как процесс компенсации.

Фигура: 1. Бяла мишка, заразена с Y. pestis subsp. pestis I-2638. Перитонеална течност. Чревни мастоцити. Оцветяване по Романовски - Гиемза, ув. х 100.

В първите условия на изследването атипичните MC съставляват 21,0 ± 1,8% от общия брой MC; до последните членове тези показатели се увеличават до 25,2 ± 2,1%. Нетипичните TC имат минимален функционален потенциал и са много по-малки. Диаметърът на клетката е 6,8-8,6 μm, което е 2,3 пъти по-малко средно (стр< 0,05), по сравнению с диаметром типичных ТК. Таких клеток значительно меньше в перитонеальной жидкости белых мышей, зараженных Y. pestis subsp. altaica И-2359, и только в период 120-180 мин после заражения отмечаются единичные интестинальные тканевые базофилы. У животных других опытных групп атипичные ТК не выявляются.

Като цяло, активирането на MC системата отразява общото адаптивно преструктуриране на организма в отговор на въвеждането на антигена. Дегранулацията на тъканните базофили следва пътя на цялостно-гранулираната екзоцитоза (фиг. 2). Функционалната активност на тъканните базофили на перитонеалната течност на опитни животни има фазов характер. Наблюдава се най-високият IDTC

при бели мишки 60 минути след инфекция с Y. pestis subsp. pestis I-2638 - 3,9 ± 0,6, което е 18,5 пъти (стр< 0,01) выше значения у интактных животных, затем показатель резко снижается, но к 180 мин исследований он вновь повышается, превышая значение в контрольной группе в 4,4 раза (р < 0,01). У селекционных клонов Y. pestis subsp. pestis И-3479 и И-3480 максимальное значение индекса дегрануляции имеет место через 90 мин от начала опыта и составляет 2,0 ± 0,3 и 1,3 ± 0,4 соответственно, при этом у белых мышей II опытной группы показатели во все сроки исследования были выше, чем у животных III опытной группы.

Фигура: 2. Бяла мишка, заразена с Y. pestis subsp. pestis I-2638. Перитонеална течност. Мастоцитни клетки. Дегранулация. Оцветяване по Романовски - Гиемза, ув. х 100.

Най-силно изразен фазов характер на промени в тъканните базофили се наблюдава при бели мишки от IV експериментална група. Максималната стойност на IDTC пада на втория и четвъртия етап от изследването, надвишавайки стойностите на непокътнатите животни с 5,8 и 7,4 пъти (p< 0,05) соответственно. У особей, зараженных Y. pestis subsp. altaica И-2948/3, только на двух сроках исследования (60-90 мин) регистрируется увеличение дегрануляции тучных клеток в 3,6 и 2,6 раза соответственно (р < 0,05), в другие сроки данные статистически не значимы. У белых мышей V опытной группы максимальное значение ИДТК приходится на второй и последний срок исследования - 0,99 и 0,92 у. е., при в контроле отмечается 0,21 у. е.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По този начин развитието на инфекциозния процес в първите часове след инокулация на чумния патоген зависи от неговия плазмиден профил, тъй като най-изразените промени в количествения и качествения клетъчен състав на перитонеалната течност са открити при експериментални животни при заразяване с щамове с pYP + pYV + pYT +.

Фазичността, разкрита по време на експеримента в промяната в количествения състав на мастоцитите на перитонеалната течност, особено при индивиди, заразени с вирулентния щам на Y. pestis subsp. pestis I-2638 (pYP + pYV + pTP33 + pYT +), както и наличието на незрели и нетипични форми на MC показва развитието на процесите на компенсация.

По принцип активирането на системата от мастоцити отразява общото адаптивно преструктуриране на организма в отговор на въвеждането на антигена.

ЛИТЕРАТУРА ЛИТЕРАТУРА

1. Анисимов А.Н. Фактори на Ypestis, осигуряващи циркулацията и запазването на патогена на чумата в екосистемите на природните огнища. Съобщение 1 // Молекулярна генетика, микробиол. и вирол. - 2002. - No 3. - С. 3-23.

Анисимов А.Н. Фактори на Y. pestis, осигуряващи циркулация и съхраняване на чумния инфекциозен агент в екосистемите на природните огнища. Доклад I // Molekuljarnaja genetika, mikrobiol. i virusol. - 2002. - N 3. - С. 3-23. (на руски)

2. Балахонов С.В. Откриване на нуклеотидни последователности на гени pla, pstl и cafl върху криптичния плазмид на 33 kd щамове Yersiniapestis от огнището на чумата в Туван // 8th Int. Симп. на Йерсиния. -Турку, Финландия, 2002. - No 10. - С. 352-355.

Балахонов С.В. Откриване на последователности на плагенни, pstl и cafl нуклеотидни последователности в криптичен плазмид 33 kb щамове Yersinia pestis от фокус на чума Tuva // 8th Int. Симп. на Йерсиния. - Турку, Финландия, 2002. - No 10. - С. 352-355. (на руски)

3. Витязева С.А., Старовойтова Т.П., Бушкова А.В. Базофили на тъканите като представители на голяма клетъчна популация на системата APUD. - Деп. във ВИНИТИ No 376-В2010 на 17.06.2010г. - 18 стр.

Витязева С.А., Старовойтова Т.П., Бушкова А.В. Базофили на тъканите като представители на многобройна клетъчна популация на APUD-система. - Деп. във ВИНИТИ N 376-В2010 17.06.2010. - 18 стр. (на руски)

4. Красноженов Е.П., Федоров Ю.В. Влияние на инфекциозния процес върху морфологичните и функционални характеристики на тъканните базофили // Zh. микробиол., епидемиол. и имунол. - 1996. - No 1. - С. 107-108.

Красноженов Е.П., Федоров Ю.В. Влияние на инфекциозния процес върху морфофункционалните характеристики

на тъканни базофили // Журн. микробиол., епидемиол. i имунол. - 1996. - No 1. - С. 107-108. (на руски)

5. Лебедева С. А., Трухачев А. Л., Иванова В. С., Арутюнов Ю. И. и други Променливост на причинителя на чумата и проблеми при нейната диагностика / Изд. S.A. Лебедева. - Ростов на Дон: Антей, 2009. - 533 с.

Лебедева С.А., Трухачев А.Л., Иванова В.С., Арутюнов Ю.И. и др. Разнообразие от чумен инфекциозен агент и проблеми при неговата диагностика / Изд. от S.A. Лебедева. -Ростов на Дон: Антей, 2009. - 533 с. (на руски)

6. Меншиков В.В. и други лабораторни методи за изследване в клиниката. - М.: Медицина, 1987 г. - 365 с.

Меншиков В.В. и др. Лабораторни методи за изследване в клиниката. - Москва: Медицина, 1987. - 365 с. (на руски)

Нормалната серозна течност на коремната кухина е бистра и светложълта, обем по-малък от 50 ml. Ако течността в коремната кухина се натрупва в значителни количества, тя се нарича асцитна. Асцит - абдоминална воднянка, воднянка на корема, значително натрупване на свободна течност (обикновено транссудат) в коремната кухина. Асцитът може да възникне внезапно (например при тромбоза на порталната вена) или да се развие постепенно, в продължение на няколко месеца, придружен от метеоризъм, който първоначално може да доминира в клиничната картина. Понякога в перитонеалната кухина се натрупват от 8 до 30 литра асцитна течност. При физически преглед на пациента може да се разпознае асцит, ако в перитонеалната кухина има поне 1 литър течност.

ПОЛУЧАВАНЕ И ОБРАБОТКА НА МАТЕРИАЛИ ЗА ЛАБОРАТОРНО ИЗСЛЕДВАНЕ
Серозна течност на коремната кухина се получава чрез пункция на ректално-маточната кухина (пространство на Дъглас, джоб) (culldocentesis), чрез перкутанна пункция (парацентеза) или чрез лапароскопия.

В същото време трябва да се вземат 5 ml венозна кръв, за да се определи градиентът "серумно-асцитна течност" за албумин и други биохимични параметри.

Препоръчително е да се извърши цитологично изследване на асцитна течност веднага след доставяне на пробата в лабораторията. Ако спешният анализ е невъзможен, пробата трябва да се съхранява в хладилник за не повече от 12 часа, използвайки хепарин или натриев цитрат като антикоагулант.

КЛИНИЧНА И ДИАГНОСТИЧНА СТОЙНОСТ НА ПРОМЕНАТА В ПОКАЗАТЕЛИТЕ НА СЕРОЗНА ТЕЧНОСТ В КОРЕМНАТА КУХА
Основните задачи на лабораторния анализ на асцитна течност са:
установяване на доброкачествения или злокачествения характер на излива;
диференциация на неинфекция / инфекция на течността.

Асцитът при портална хипертония, хепатоцелуларен карцином и чернодробни метастази, без да ги разпространява по перитонеума, е транссудат.

Асцитът при чернодробни заболявания, в случаите на панкреатит, перитонеална туберкулоза и при злокачествени тумори с метастази в перитонеума, като правило, е резултат от ексудат.

Разработени са подходящи лабораторни критерии за диференциална диагноза на портални и злокачествени (перитонеални метастази) видове асцит. Основните лабораторни показатели за разделяне на асцита в ексудат и транссудат при липса на злокачествени клетки са съдържанието на албумин, нивата на холестерола и фибронектина. Трансудатът се характеризира с висок градиент на албумин между серума и асцитната течност (\u003e 11 g / L), а за ексудата, напротив, асцитната течност съдържа голямо количество албумин и градиентът за албумин между асцитна течност и серум е незначителен (
В случай на хилозна асцитна течност са показани определянето на триглицеридите в нея и настройката на липопротеиновата електрофореза. Нивото на раково-ембрионален антиген над 2,5 μg / L асцитна течност има висока клинична специфичност и прогностична стойност, близка до 100% за тумор с метастази в перитонеума.

При изследване на албумин, проби от серум и асцитна течност трябва да се вземат едновременно. Концентрацията на албумин в асцитна течност трябва да се определя чрез имунонефелометрични или имунотурбидиметрични методи. Фотометричното определяне на албумин с бромкрезол зелено дава надценени резултати при концентрация на албумин над 7 g / L; следователно този метод не е подходящ за определяне на градиента на албумина. Общо ниво на протеин над 30 g / l за диагностика на транссудат има диагностична специфичност от 86% и диагностична специфичност от 83%.

Преброяването и диференцирането на клетките за определяне на неутрофилни гранулоцити се извършва в EDTA-асцитна течност. Ако в пробата има кръв, тогава е необходимо да се определи:
съотношението на еритроцитите към левкоцитите, за да се оцени възможността за кървене от стомашно-чревния тракт или примес на "пътуваща" кръв;
съдържанието на левкоцити (високият им относителен брой показва възпалителен процес);
съдържанието на неутрофилни гранулоцити (асцитите с преобладаване и абсолютно съдържание на неутрофили над 250 / μl се класифицират като инфекциозни).

Ако цитологичното изследване не може да се извърши в рамките на 12 часа, пробата може да се съхранява в хладилник до 2 дни, но материалът трябва да се фиксира чрез добавяне на 50% алкохол в съотношение 1: 1.
Определянето на патогенната микрофлора в асцитната течност се извършва по същия начин, както в кръвта - чрез култивиране при аеробни и анаеробни условия.

ОБЩИ СВОЙСТВА (МАКРОСКОПСКА ТЕЧНОСТ)
Асцитната (перитонеална) течност по своята природа е по-често серозна, по-рядко хеморагична, хилезна, лигавична. Леката, прозрачна или с жълтеникав оттенък асцитна течност е по-често транссудат. Мътната серозна течност е характерна за перитонита, който се появява като усложнение на апендицит, панкреатит, чревна непроходимост и първична бактериална инфекция. Зеленикав цвят, оцветяване на жлъчката се получава при перфорация на жлъчния мехур, дванадесетопръстника, тънките черва, както и при холецистит, остър панкреатит. Асцитната течност придобива зеленикав цвят, когато концентрацията на билирубин в нея надвишава 100 μmol / l. Ако концентрацията на билирубин в асцитната течност е по-висока, отколкото в серума, това е доказателство за перфорация на жлъчния канал или пикочния мехур. Млечният вид на серозна течност (хилозен излив) се появява, когато в асцитната течност има голям брой хиломикрони. Това се случва най-често при увреждане или запушване на гръдния лимфен канал, причинено от туберкулоза, цироза на черния дроб и може да възникне при левкемия (лимфом). Възможна псевдохилусна инфузия с въвеждане на големи обеми кръвни заместители на пациента.

Хеморагичната серозна течност на коремната кухина може да се появи с коремна травма с разкъсване на вътрешните органи, по-специално с разкъсване на фалопиевата тръба по време на извънматочна бременност, както и с разпространение на злокачествен тумор по серозната мембрана. Течността има червен цвят с примес на "пътуваща" кръв по време на парацентезата. Асцитната течност придобива кафяв цвят поради кървене в коремната кухина с туберкулозен перитонит, метастази в перитонеума и след травматични наранявания на коремните органи. При интегралната оценка на състоянието на пациенти с перитонит се използва перитонеалният индекс на Манхайм, при изчисляването на който един от най-значимите показатели е естеството на ексудата

БИОХИМИЧНИ ПОКАЗАТЕЛИ
Следните фактори влияят главно върху концентрацията на общия протеин в асцитната течност:
концентрацията на общия протеин в серума, с която нивото на протеин в асцитната течност има пряка връзка;
нивото на порталната хипертония, с което има обратна връзка. В допълнение, концентрацията на общия протеин в асцитната течност се влияе от
прием на диуретици.

Показанията за определяне на общия протеин в асцитна течност са:
профилактични антибиотици за предотвратяване на бактериален перитонит;
диференциална диагноза на първичен и вторичен (въведен) бактериален перитонит;
асцит при сърдечна недостатъчност.

Общ протеин
При прагова стойност на общото съдържание на протеин в асцитна течност от 25 g / l, класическите идеи за разделяне на транссудат и ексудат въз основа на протеиново изпотяване се потвърждават само с 56%, тоест те практически нямат лабораторно потвърждение . Това се дължи на факта, че общото съдържание на протеини е ниско в инфекциозната етиология на асцита, въпреки че ексудативният характер на асцита е безспорен. От друга страна, общото съдържание на протеин в асцитната течност е високо при пациенти със сърдечна недостатъчност, при които асцитната течност се счита за транссудат.

Обща концентрация на протеин над 30 g / L показва ексудат с клинична чувствителност 93% и специфичност 85%. Съотношение на протеин над -5 показва ексудат с клинична чувствителност 93%, специфичност 85%. При асцит, причинен от злокачествени тумори, с изключение на хепатоцелуларен карцином, общата концентрация на протеин е 49-65 g / l, докато при чернодробна цироза и хепатоцелуларен карцином е в диапазона 17-21 g / l. Пациентите с чернодробна цироза и нива на протеин в асцитна течност под 15 g / L имат лоша прогноза. Ниското ниво на протеин в асцитната течност е характерно за инфекциозната природа на асцита, в същото време при вторична бактериална инфекция и при туберкулозен перитонит в асцитната течност постоянно се определя ниво на протеин над 30 g / l.

Албумен
Градиентът на албумина между серума и асцитната течност се определя от нивото на порталната хипертония. Пациентите с градиент на албумин над 11 g / L имат портална хипертония, докато тези с градиент под 11 g / L нямат. При чернодробна цироза с портална хипертония, градиент на албумин над 11 g / l има клинична специфичност от 97%. Асцитите при смесени видове - поради цироза на черния дроб и метастази в перитонеума или цироза на черния дроб и туберкулозен перитонит - също са придружени от градиент на албумин над 11 g / l.

При разграничаването на транссудата от ексудата градиентът на албумина е по-важен от общия протеин. Трябва да се има предвид, че когато се използват диуретици или парацентеза, нивата на албумина и общия протеин в асцитната течност се променят.

При пациенти с напреднал перитонит степента на намаляване на серумната концентрация на албумин е високо информативен прогностичен показател, който позволява да се оцени тежестта на заболяването и риска от неблагоприятен изход. Намаляването на нивото на албумин в кръвта възниква както поради увеличаване на белтъчния катаболизъм, характерен за острата фаза на всеки възпалителен процес, така и поради ексудация в коремната кухина. Перитонеалният ексудат съдържа значително количество протеин. Смята се, че до 50% от цялата извънклетъчна течност в тялото може да се премести в коремната кухина. С развитието на оток отначало процесът на абсорбция на течности от перитонеума дори се ускорява, но след това, поради нарушение на микроциркулацията, той рязко се забавя - възниква натрупване на ексудат. Определено количество протеин, включително албумин, освободен от кръвта, се губи в тялото; високият протеинов излив води до хипоалбуминемия. Освен това винаги има значителен оток на пред- и ретроперитонеалната тъкан и други тъкани поради действието на биологично активни вещества: ензими, кинини, хистамин, поради което албуминът се отлага в тъканите. Заедно с намаляване на синтеза (албуминът е отрицателен реагент на острата фаза на възпаление) и увеличаване на разпадането (преобладаване на катаболните процеси в организма), отделянето на албумин в коремната кухина и отлагането му в оточните тъкани са основна причина за прогностично неблагоприятното явление - намаляване на концентрацията на албумин в кръвния серум.

Проникването на албумин от кръвта в излива се характеризира със стойността на общата концентрация на албумин в излива. В повечето случаи общата концентрация на албумин в излива е тясно свързана със стойността на общата концентрация на албумин в излива (серумна концентрация на албумин). В случаите, когато общата концентрация на албумин в излива е\u003e 34 g / L и общата концентрация на албумин в излива е значително по-ниска от общата концентрация на албумин в излива, пациентите имат лек ход на следоперативния период; резултатът от заболяването е благоприятен; изтичането през дренаж е незначително.

В случаите на значителни разлики в състоянието на албумин в излива и серума, стойността на общата концентрация на албумин в излива не е свързана с концентрацията на албумин в кръвта; очевидно има протеолитичен ефект върху албумина в ексудата, което води до неговата промяна и разрушаване. В други случаи абсолютната стойност на общата концентрация на албумин в излива зависи от стойността на общата концентрация на албумин в излива, а не от активността на възпалителния процес в коремната кухина. За да се характеризира тежестта на възпалителния процес в коремната кухина, е подходящо съотношението на общата концентрация на албумин в излива, което характеризира степента на пропускливост на съдовата стена за албумин. Параметърът на общата концентрация на албумин в излива отразява тежестта на състоянието на пациента, а параметърът на общата концентрация на албумин в излива отразява тежестта на възпалителния процес в коремната кухина.

Ендотоксин
При пациенти с фекален перитонит (перфорация на дебелото черво) концентрацията на ендотоксин в перитонеалната течност може да достигне 1000 μg / L. При дифузния бактериален перитонит концентрацията на ендотоксин обикновено е относително ниска. Ако в следоперативния период микрофлората на дебелото черво продължи да навлиза в коремната кухина (ендотоксинът в перитонеалната течност се увеличава), това е много голяма заплаха от дифузен перитонит и смърт на пациента.

Глюкоза
При небактериален перитонит стойността на съотношението глюкоза-асцитна течност / глюкаплазма е повече от 1, а при бактериален перитонит тази стойност е по-малка от 1. Концентрацията на глюкоза в асцитната течност е по-малка от 2,8 mmol / l характерни за бактериалния перитонит. В повечето случаи на туберкулозен перитонит концентрацията на глюкоза в асцитната течност е под 1,7 mmol / l. Намалява се и при злокачествени тумори с метастази, които са причините за асцит.

БАКТЕРИОЛОГИЧНО ПРОУЧВАНЕ
Когато перитонеалната течност е заразена с монокултура, културните изследвания имат клинична чувствителност над 85-90%, докато такъв показател като съдържанието на неутрофилни гранулоцити / μl е повече от 250 - само 50%. Бактериологичните изследвания показват, че в 70% от случаите има грам-отрицателна микрофлора, обикновено Е. coli, в 20% от случаите - грам-положителна.

Етиологичното значение на анаеробните микроорганизми е доказано при всички сложни интраабдоминални инфекции, където те са част от полимикробни асоциации. Clostridium perfringens и Clostridium septicum участват в развитието на вторичен перитонит, интраабдоминален абсцес и сепсис при перфорация на дебелото черво и крайния илеум. При усложнени тумори на дебелото черво 70-85% от пациентите имат бактериемия поради Clostridium septicum. При апендицит, Bilophila wadsworthia се екскретира от излива. Смесените инфекции често включват Peptococcus spp., Peptostreccoccus spp. Срещащи се в 90-95% от случаите, Actinomyces spp., Prevotella spp., Lactobacillus spp., Fusobacterium spp. най-трудното при диагностицирането и лечението на актиномикотични чернодробни абсцеси. Бактероидите, предимно Bacteroides fragilis и Bacteroides thetaiotaomicron, са от водещо значение при интраабдоминални инфекции. Честотата на изолиране на Bacteroides fragilis при вторичен перитонит достига 22,8-44,5%. Има доказателства за етиологичното значение на анаеробите при първичен перитонит. Clostridium perfringens и Bacteroides fragilis се екскретират при всички пациенти с инфекции на жлъчните пътища с признаци на хипертония на жлъчката или ендопротези, които осигуряват проходимост на общия жлъчен канал. При панкреатит, бактероидите и клостридиите се изолират сред патогените в 5-14% от случаите. При вътреболничната интраабдоминална инфекция е значима асоциацията на мултирезистентни ентеробактерии, Pseudomonas aeruginosa, ентерококи и анаероби. Раневите инфекции при пациенти след коремни интервенции при 3,9% са причинени от Bacteroides spp., При 1,1% - от Clostridium perfringens. Развитието на перитонит и смъртността при интраабдоминална инфекция се дължи на грам-отрицателни аероби, а образуването на интраабдоминални абсцеси при оцелелите се дължи на анаеробна микрофлора.

Прогресиращ микробно-възпалителен процес в коремната кухина (на фона на оперативна травма, намаляване на съпротивлението на организма и др.) Протича много бързо и в рамките на 4-5 дни може да достигне етап, изискващ хирургическа намеса. Динамичността на процеса, високата вероятност от реинфекция, развитието на устойчивост на микрофлора изискват както емпирично предписване на антибактериална терапия едновременно с индикативен микробиологичен експресен анализ (микроскопия, газова хроматография), така и оценка на чувствителността на микроорганизмите в клиничния материал с помощта на дискове с антибиотици и постоянно наблюдение на бактериологичната ситуация в огнището на възпалението. Рутинният бактериологичен метод на култивиране позволява получаването на резултата 24-72 часа след началото на проучването, разкривайки естеството на патогенната микрофлора, потвърждавайки правилния избор на антибиотична терапия или предполагайки необходимостта от нейната корекция. Необходим е постоянен микробиологичен мониторинг, тъй като микробиологичната ситуация във фокуса на инфекцията може значително да се промени по време на патологичния процес и да изисква промяна в терапията.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА КРЪВНИ КЛЕТКИ
Еритроцити в EDTA-асцитна течност
Течността за перитонеална промивка съдържа по-малко от 25 000 еритроцити / μL. В асцитната течност еритроцитите се натрупват след травма или са проява на туберкулозни или злокачествени лезии на перитонеума. Подобно съотношение на броя на еритроцитите и левкоцитите в асцитната течност и кръвта показва ятрогенна лезия ("пътуваща" кръв) или кървене в коремната кухина.

Левкоцити
Определянето на левкоцитите в перитонеалната течност може да се извърши количествено чрез преброяване в камерата на Горяев или полуколичествено с помощта на диагностични ленти с използване на тестова зона за определяне на левкоцитите. Чувствителността на тестовата зона за левкоцити е 3000 клетки / μl. Диагностичната чувствителност на откриването на левкоцити по метода "суха химия" в перитонеалната течност е 88%, специфичността е 94%.

Броят на левкоцитите в асцитната течност, рН и концентрацията на лактат по време на инфекция с асцитна течност се различават значително от стойностите на тези показатели при стерилен асцит, но всички тези стойности варират приблизително при един и същи вид и не е възможно да се прави разлика между асцит при туморен и инфекциозен перитонит.

Относителното съдържание на неутрофилни гранулоцити над 25% от популацията на левкоцитите от асцитна течност се счита за патологично и характерно за бактериалния перитонит. При пациенти с чернодробна цироза броят на левкоцитите в асцитната течност е обратно пропорционален на обема на течността. Броят на левкоцитите в асцитната течност се увеличава с намаляване на обема на асцита в резултат на лечение с диуретици, докато относителното съдържание на неутрофили във формулата на левкоцитите не се променя.

Ако броят на левкоцитите е повече от 500 / μl, особено ако броят на гранулоцитите е повече от 250 / μl, има голяма вероятност за първичен бактериален перитонит. В този случай диагностичната специфичност на потвърждаването на тази диагноза е 93%, чувствителността е 84%. При рак на панкреаса и хепатоцелуларен рак има умерена левкоцитоза - 300-1000 / μl. При алкохолна цироза броят на левкоцитите в асцитната течност нараства до 1100-21 000 / μl.

Лимфоцитозата в асцитната течност е признак на продължителна застояла ексудация, хронично възпаление, туберкулоза или туморен процес. При пациенти с цироза на черния дроб и хилозна асцитна течност относителното съдържание на лимфоцити в него е от 12 до 96%, средно 70%.

Туморни маркери
Въглехидратен антиген 19-9
При асцитна течност при прагова стойност (дискриминантно ниво) от 30 U / ml диагностичната чувствителност на злокачествен тумор е 52%, а диагностичната специфичност е 100%.

Раково-ембрионален антиген
Изследването на раково-ембрионалния антиген в асцитната течност дава възможност да се прави разлика между доброкачествени и злокачествени заболявания с диагностична специфичност и чувствителност от 83%. С прагова стойност на раково-ембрионалния антиген от 2,5 μg / ml, диагностичната чувствителност е 45%, диагностичната специфичност е 100%. Ако определянето на раково-ембрионалния антиген в асцитната течност се комбинира с изследване за наличие на туморни клетки, диагностичната чувствителност в случай на злокачествен тумор се увеличава до 80%. Трябва да се отбележи, че изследването на раково-ембрионалния антиген в асцитна течност е от малко значение за диагностиката на дифузен злокачествен мезотелиом: раково-ембрионалният антиген се определя само в 1-9% от случаите на тази патология. В същото време раково-ембрионалният антиген се определя в 80% от случаите на асцит, свързан с туморни лезии при рак на стомаха, гърдата, белия дроб.

ЦИТОЛОГИЧНО ПРОУЧВАНЕ
Най-висока аналитична чувствителност се постига по време на цитологичното изследване на препарати, оцветени по Pappenheim и Leishman и, ако е необходимо, с допълнително цитохимично изследване. Диагностичната чувствителност при откриване на туморни клетки под светлинен микроскоп е 40-70%. Ако е възможно да се получат клетки от 200 ml или повече асцитна течност, диагностичната чувствителност се увеличава до 70-90% с почти 100% диагностична специфичност. Понякога лабораторното откриване на туморни клетки в асцитна течност предхожда клиничната проява на тумора от 3 години или повече.

При жените туморните клетки в асцитната течност в низходящ ред се откриват по-често в тумори на гениталния тракт, особено на яйчниците, след това рак на гърдата и стомашно-чревния тракт. При мъжете разпространението по перитонеума най-често се определя с тумори на стомашно-чревния тракт, левкемия. В около 80% от случаите туморът принадлежи към аденокарцином. От патологичните процеси, които са характерни за лезии на перитонеума и практически не се случват в плеврата и перикарда, трябва да се отбележи псевдомиксома на перитонеума.

Поражението на перитонеума се наблюдава при муцинозен тумор, най-често граничен муцинозен тумор на яйчника или мукоцеле на апендикса, както и при силно диференциран муцинозен аденокарцином на яйчника или апендикса. Смята се, че лезията може да се развие с разкъсване на кистозен тумор и генерализирано разпространение на туморни клетки в коремната кухина. В същото време в коремната кухина се натрупва голямо количество слуз, която трудно се аспирира поради високата си плътност. Аспиратни тампони за псевдомиксома на перитонеума съдържат голямо количество положителна слуз, която е устойчива на хиалуронидаза. По правило туморните клетки са малко или не се откриват в няколко препарата, поради което, за да се установи диагнозата, често е необходимо да се разгледат няколко цитонамазки или да се направи втора пункция.

За да установите доброкачествения или злокачествения характер на лезията, трябва да бъдете много внимателни. При доброкачествена лезия в цитоплазмата се съдържат клетки с малък размер, с малки тъмни ядра, умерено изобилна цитоплазма, вакуоли. Слузта често съдържа нишки от фиброцити. Невъзможно е да се направи заключение за злокачествен процес само въз основа на откриване на голямо количество слуз, тъй като това може да е резултат от разкъсване на мукоцеле на апендикса или доброкачествен муцинозен цистаденом на яйчниците. Особено внимание трябва да се обърне в случаите, когато слуз от доброкачествен тумор се комбинира с групи мезотелиални клетки с реактивни промени. За да установите естеството на лезията, трябва внимателно да изследвате слуз-продуциращите клетки за наличие или липса на признаци на злокачествено заболяване.